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復性溫度的選擇標準應該是可擴增范圍的中間溫度。

在使用溫度梯度的方法尋找復性溫度時，新手往往會選擇擴增產物多的溫度條件，然而在此后的非梯度擴增時擴增效果又不太理想。出現這種現象的主要原因是復性溫度的選擇標準不對。本人10多年前做過數千個基因的擴增，通過溫度梯度實驗發現，能擴增出來的溫度范圍一般在3-30度。選擇的標準應該是可擴增范圍的中間溫度。
因為：
1、擴增產物量的影響因素很多，有些是隨機的。從定量PCR的平臺期高低的不規律可以看出來。
2、不同儀器、不同位置的溫度及溫度變化曲線是有差異的。按照儀器廠家的出廠標準也準確性+-0.3度及均勻性+-0.3度
3、PCR儀進行梯度擴增時的溫度準確性會更差


選擇中間溫度可以消除儀器溫度差的影響。


另外，進行溫度梯度時模板量的選擇也是非常重要的。