蛋白質的雙向電泳的第一向為等電聚焦（Isoelectrofocusing, IEF）,根據蛋白質的等電點不同進行分離；第二向為SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），按亞基分子量大小進行分離。經過電荷和分子量兩次分離后，可以得到蛋白質分子的等電點和分子量信息。
注意事項：
1. 一向聚焦與二向電泳之間需要平衡，時間視蛋白質的性質而定，一般為10min，最多不超過15min。
2. 過量的上樣量會引起雙向圖形畸形，特別在一向聚焦時，當樣品濃度超過5mg時，則蛋白質凝聚和沉淀，使二向時產生水平和垂直條紋。
3. 含尿素的試劑均應避免過高的溫度處理，一般不要超過30℃，否則尿素分解產生異硫氰酸鹽會引起羧基甲酰化而導致電荷不均一性。
4. 第一向中過量的去污劑會嚴重影響雙向電泳圖譜，因此聚焦完畢進行平衡前，用雙蒸餾水沖洗膠條，以除去殘留的去污劑。
5. 雙向電泳中雙向凝膠間的界面緊密接觸非常重要，如果接觸不好或者兩者之間留有氣泡，則導致轉移時分子擴散。
6. 雙向電泳中的條紋現象是常見的問題。水平條紋可能與一向電泳時間不夠，聚焦不好有關，或者在加樣處產生沉淀和引起重新溶解所致；縱向條紋則表明樣品沒溶解，這可以通過調整樣品量，增加電泳時間，改善樣品的溶解狀態，同時在加樣前通過高速離心以除掉所有不溶物。
